珍稀動物恐受影響
可可西里有冰川、雪山、石林，是全國最大「無人區」，又是國家級自然保護區，是青藏鐵路必經之地。目前在該區棲息的約50,000隻藏羚羊、藏野驢等珍稀動物會否受到影響，是外界最關注的焦點之一。
可可西里夾在唐古拉山和崑崙山間，面積8.3萬平方公里，氣候惡劣，卻是野生動物的天堂。可可西里的野生動物230多種，其中國家重點保護的一、二類野生動物有20多種，藏羚羊被稱為「可可西里的驕傲」。
藥材資源遭受破壞
西藏藥業總經理周強林指出，他最關注青藏鐵路對自然生態環境的破壞。他指出，進藏成本降低後，大量人流湧入西藏，大家都知道藏藥的好處，藏藥因而會被懂藏藥和不懂藏藥的人收購，導致藥材資源受破壞。
周強林稱，西藏藥業的生產加工主線在西藏，像鋁箔、紙盒等，以往都要空運入藏，成本不菲，開通鐵路，估計集團運輸費用節省50%。而人員出入，日後若能坐火車，相信差旅費用將大幅減少。
西藏入地震活躍期
中國地震專家預測，西藏已進入21世紀初以來的第三個地震活躍時期，將持續到2014年前後，青藏鐵路沿線有100多條地震帶，且未來一段長時期處於劇烈運動中。目前，青藏鐵路西藏段只有那曲鎮有一個地震監測台站，難以對全面監測。據悉，青藏高原從唐古拉山以北到崑崙山口地段，就有140多條地震帶，而唐古拉山以南到拉薩的地震帶也有70條。2001年11月14日，崑崙山口曾發生黎克特制8.1級地震。
38個車站無人值守
青藏鐵路所經地段環境艱苦、氣候惡劣，以致45個車站有38個無人值守，鐵路安全問題倍受關注。青藏鐵路公司表示，列車運行控制系統採用無線通訊和衞星定位技術相結合，牧區的鐵路線路兩側，將加裝結實美觀的隔離柵欄，重點目標由武警及保安看守，對15座橋樑等重點部位安裝綜合視頻監控系統；為公安配備精良的武器裝備，進行機動巡邏，以確保格爾木─拉薩段的治安安全。
凍土退化危害鐵路
中國科學院凍土專家吳紫汪表示，受全球氣候變暖影響，近30年來，青藏高原的凍土持續日數縮短、深度減少，「十年後它（青藏鐵路）會因凍土退化出現安全問題。」
不過，青藏鐵路建設總指揮長黃弟福稱，鐵路已盡量繞避地質複雜地段，在高含冰量的不穩定凍土區採取以橋代路等方式，保障安全。針對鐵路被指破壞高原的物種多樣性及植被覆蓋率，黃弟福指，高原植被不僅沒因建鐵路而減少，反因凍土區植被恢復試驗成功，對豐富和恢復高原植被更有利。
藏文化神秘感消失
西藏文化充滿神秘感，但隨着青藏鐵路通車，勢將帶來更多人流、物流，破壞當地原始景觀，藏民在高原上的牧歌式生活方式，也將受到衝擊。
內地攝影家于雲天指，他的成名作在阿里的古格遺址上拍攝，相片中有野鴿子飛在佛塔邊，景觀原始、蠻荒，如今已蕩然無存。曾出版西藏攝影集的攝影家明可也說，原本走在拉薩八角街的石板路，可聽見朝聖人士磕頭的聲音，但現在像北京的王府井。